Southern Blot杂交
Southern Blot
实验原理
Southern Blot用于凝胶电泳分离的酶切后DNA片段混合物中的特定性性片段（目标基因）的检测 。首先提取基因组DNA，然后酶切切成小片段，使用吸水纸将凝胶中的DNA通过虹吸作用被转移到尼龙膜上，然后用标记生物素的探针（核酸序列）与转移到膜上的DNA进行杂交，最后通过显色检测目标基因的存在性。Southern Blot主要用于检测目标基因的存在性及拷贝数多少，尤其用于检测转基因植物染色体基因组中是否已插入外源基因。
实验准备
1.固相支持介质
常用的有尼龙膜（nylon）和硝酸纤维素膜（NC）其特点如下：
（1）正负电荷尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型；硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格最便宜。
（2）就结合能力而言：尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480－600μg/cm2，可结合短至10bp的核酸片段；硝酸纤维素膜具有较强的吸附单链DNA和RNA能力，特别再高盐条件下其结合能力可达80－100μg/cm2，对于200bp的核酸片段结合能力不强；
注：硝酸纤维素膜在低盐环境下结合核酸能力不强，因此不适合用电转移法。
（3）就结合方式而言：硝酸纤维素膜靠疏水相互作用来吸附核酸，容易被洗脱。而尼龙膜则通过离子键结合，结合牢固，不容易洗脱。
（4）就温度适应性而言：尼龙膜经烘烤或紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合；硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA，结合不牢固；
（5）就韧性而言：尼龙膜较强；硝酸纤维素膜较脆，易破碎；
（6）就重复性而言：尼龙膜可反复用于分子杂交，杂交后，探针分子可经碱变性被洗脱下来；硝酸纤维素膜不能重复使用。尽管如此，尼龙膜一般也不反复使用，避免可能的因素对结果产生影响
2..滤纸。购买大规格的滤纸。
3..托盘，玻璃板，直尺，铅笔，保鲜膜。
4.fermentas探针标记检测试剂盒，预杂交液二，及其它试剂（见试剂配制）
时间安排
第一天：基因组的提取及酶切：上午提取，下午检测，测浓度，晚上酶切。
第二天：上午检测酶切情况，并作浓缩，并跑上电泳；下午标记探针，配试剂，晚上转膜。
第三天：上午继续转膜，下午预杂交，杂交。
第四天：上午洗膜检测。
第五天：看结果。
实验步骤
本实验标准采用带正电荷的尼龙膜。
（一）DNA提取参见实验。注：提取完后，加入1/100体积的10mg/ml的RNAase，37℃处理40min，电泳检测后把所有离心管中的DNA合成一管然后用快速核酸检测仪测量DNA的浓度。
Southern杂交对基因组DNA的质量要求较高，用于Southern杂交的DNA必须长度完整，大小在20kb-50kb之间，没有剪切或降解。
（二）DNA酶切：对于基因组的酶切一般选用多种限制性内切酶，既可以单酶切也可以双酶切或多酶切。选酶的原则是该酶在该基因内部无切点，且具有识别六个碱基序列的核酸内切酶（eg：EcoRⅠ，BamH Ⅰ，Hind Ⅲ）这样得到的酶切片段较大，易于吸附于膜上，不容易洗脱。同时应避免使用甲基化敏感的酶（eg：Pst Ⅰ，SalⅠ，XhoⅠ，ClaⅠ）酶切所需DNA的量一般为10μg～20μg，所需限制性内切酶量为10Unit酶/1μg
400μl的酶切反应体系：
10～30μg DNA
酶40ul（一般选取2—3种酶进行切割）
10×Buffer 40ul
BSA 40ul
无菌水至400ul
酶切体系大小的确定一般根据DNA量的多少确定，适当扩大酶切体系可以保证酶切完全。根据酶的使用说明书选择相应的酶切温度，酶切16h。取10ul电泳检测酶切效果。正常电泳图谱呈现一连续的弥散带，但有时还经常可见到一些明亮条带，这是重复序列而不是电泳假象。但是如果靠近点样孔附近有一条明亮的带，说明酶切不完全。如果泳道的边缘较亮，说明点样过大。如果泳道中间变宽，下段前缘变细小，说明是电压较高造成。如果消化不彻底，可延长反应时间，但是一般不能超过20h。如果延长时间不凑效，可采用补充酶液再消化的策略。结果图片如下：
注：
1. 建议使用TBE，缓冲能力强，产热量少。另外goldview要少加，如40ml胶加1ul即可。
2. 胶板用长的，以适合长时间电泳，保证各种不同长度大小的DNA片段能够更加有效的分离。
3.除酶切产物外，还应有marker，同时设置阴性（ck）、阳性对照（该基因的PCR产物或质粒），DNA。以对转膜杂交过程进行检测
4. 在进行大批量基因组DNA过夜酶切时，为避免酶长时间反应而导致活性的降低，最初加入的酶量应为所需量的1/2，酶切过夜后第二天早上再加入另一半，然后继续反应1小时即可实现完全酶切。
5.为了避免型号活性（识别位点错误），注意所加酶的用量不能超过酶切体系的10%即甘油含量不能超过5%。
6.甲基化酶能使DNA 不被相应的限制酶所切割，导致酶切失败。
（三）浓缩：加入1/10体积（40μl）3mol/L醋酸钠(pH 5.2)2倍体积的冷无水乙醇（或0.6～1倍体积的预冷异丙醇）-20℃沉淀DNA30min，12000r/min,离心10min。加入70%冷乙醇1ml 12000r/min,离心10min，洗涤沉淀，干燥，溶解于25μl 无菌水。
注：干燥时一定干燥至无酒精味为止，否则点样时sample may float out of well。
（四）低电压电泳：
1.关于酶切后电泳的点样。由于酶切产物经过浓缩，故浓度相当大，所以在点样时，上样缓冲液不应按照稀释至一倍即可，而应加大用量，否则将不能有效沉降DNA，而造成样品损失。另外要适当加厚一下胶，防止样品无法全部点入。
2.换用新的1×TAE或0.5×TBE电泳缓冲液和0.8%的琼脂糖凝胶以小于1V/cm（20V
左右）的电压电泳8—12h。电泳完成后，用凝胶成像系统拍照，若DNA没能有效的分离，可以将凝胶放入电泳槽继续电泳。
3.基因组样品上样时应使样品在点样孔中分布均匀后，再开始电泳，且最初电泳时应保持较高电压，以保证样品出孔。
（五）标记：修去凝胶边缘和加样孔上以及存在RNA的部分切下，并在Marker侧，切去一小三角，作为凝胶方位的标记。并用直尺测量胶的长宽，确定其大小。
6，7，8步操作时一定要小心，保持胶的完整性。
6.脱嘌呤处理：对于大于20kb的条带，可采用将凝胶置于0.2mol/L的HCl（无菌水配制）中摇晃之溴酚蓝变黄（一般5—10min），二甲苯青变成黄色/绿色后，迅速将HCl倒入废液缸，无菌去离子水洗涤数次。（强酸导致DNA脱嘌呤，能够减小DNA的大小而有利于转膜。但是，过度会导致DNA断裂成较小片段。）注：凝胶是否需要脱嘌呤处理取决于DNA片段的大小，一般可根据marker判断，如果序列>20kb，则需要脱嘌呤处理，从而保证转膜的效率，如果序列<20kb则不必进行脱嘌呤处理，否则可能出现过嘌呤，导致DNA片段太小而不能有效结合到膜上。
注：如果实验转膜过程中同时含有大于 15kb的DNA(通常为基因组)和小片段DNA(通常是基因组酶切产物)，那么在转移的过程中倾斜容器，仅使凝胶上半部分浸泡于盐酸，这样既可以提高大片断 DNA 的转移效率，又不会打碎小片段DNA。
7.变性处理：加入数倍体积的变性液，每次15min，摇床处理两次，然后无菌水冲洗。
8.中和处理：加入数倍体积的中和液，每次15min，摇床处理两次，然后无菌水冲洗。
从DNA固定于膜上到其后的杂交，这一系列步骤的顺序取决于膜的种类、转移的方法以及固定的方法。在碱性缓冲液中，DNA共价结合在带正电荷的尼龙膜上，因此杂交前不需要固定。在中性缓冲液中转移至不带电荷或带正电荷的尼龙膜上需要加热固定或紫外交联。本文以中性缓冲液为例，讲述。
9.转膜准备：
①、切一张每边比凝胶大1mm的尼龙膜，并用干净的解剖刀切下膜的一角，与凝胶所切下的角一致。同时剪10张同样大小的滤纸。（注意：需带一次性PE手套和钝头镊子，沾有油污的膜不易浸湿。）
②将尼龙膜飘浮于盛有无菌去离子水的平皿中，直到其完全浸湿后（一般5min），将其浸入适20×SSC中30min，。（注意：膜的浸湿完全与否，对DNA的转移至关重要。）而将10张滤纸浸泡在2×SSC中。
③将8张滤纸放在一片玻璃板上，形成比凝胶长且宽的支持物。将支持物放入一个大的托盘中，吸水纸两端从板边缘垂下。
④托盘中加入适当的20×SSC，直到液面几乎与支持物表面平齐。当支持物上的滤纸完全浸湿后，用玻璃棒赶走吸水纸下的气泡。
⑤将凝胶从中和液中取出，倒转使原来的底面向上。放在支持物上（使凝胶尽量与底层吸水滤纸的边同样长或略短，见图）。用玻璃棒赶走凝胶与吸水纸间的气泡。
⑥用保鲜膜包绕凝胶四周，不要覆盖有DNA的凝胶部分，以屏蔽转移缓冲液从凝胶周围短路流入吸水纸。（注：根据测量的凝胶的长度画出凝胶形状，然后在此基础上再画出一个每一边都比前面略小的图形。最后将保鲜膜放在这张纸的上面，然后象图2那样将保鲜膜固定，用刀片沿最后画的图形的痕迹将保鲜膜切下。然后这一保鲜膜既可用于封闭凝胶。）
⑦用适当的20×SSC溶液将凝胶湿润。将湿润的尼龙膜放置于凝胶上并使两者的切角相重叠。为避免产生气泡，当先使膜的一角与凝胶接触再缓慢的将膜放到凝胶上。膜的一边应恰好超过凝胶上部加样孔一线的边缘。膜一旦放在凝胶上就不要再移动了。
⑧在尼龙膜上放置10张与膜大小相同的滤纸，叠多叠卫生纸，将其放在滤纸之上，在卫生纸顶部放一400g重物压实。注：不可压过重的重物，因为这样可能会使胶伸展弯曲变扁，从而使最终长度的判断出现困难，且条带变粗。
⑨转移8～24h，并每隔2—3h更换浸湿的纸巾。尽量避免纸巾都被缓冲液浸湿。（对于大于16kb的24h以上）
⑩除去凝胶上的卫生纸和滤纸，翻转凝胶以及与之接触的尼龙膜，凝胶向上平放于干燥的吸水纸上。用极软的铅笔在尼龙膜上标记记加样孔的位置。
11将凝胶从膜上剥离，弃去凝胶。
13、紫外反射透射仪检测凝胶上DNA的残留量，用以确定转移效率。
10.DNA的固定：
1、将膜浸入6×SSC，室温放置5min，以除去粘附在膜上的凝胶碎片。
2、①真空烘烤固定：将膜从6×SSC中取出，并使多余的液体流净。将膜放在滤纸上室温晾干30min，将膜夹在两张干燥的滤纸中间，真空炉中85℃烘烤3h。（也可直接在杂交炉中烘烤）
②紫外照射交联：将潮湿的膜放在一张干燥的吸水纸上。254nm的紫外线照射使DNA交联到膜上。（其原理是紫外线照射使DNA中的一小部分胸腺嘧啶残基与膜表面带正电荷的氨基基团之间形成共价交联，但过量照射将导致大部分的胸腺嘧啶共价结合而降低杂交信号。同时，紫外线照射可能增强某些带正电荷的尼龙膜的杂交信号背景，因而应当使膜上带有DNA的一面朝向紫外。建议对潮湿的膜采用总量1.5J/cm2，干燥的膜采用0.15J/ cm2。）
3、对于不立即用于杂交的膜都应充分干燥，松弛的包于铝箔纸或吸水纸中，室温下最好保存在真空条件。或待膜冷却后，用保鲜膜包好以后保存在4℃备用。
生物素显色系统方案（根据试剂盒说明书操作）：
一、探针的合成：（300bp~1kb）
通过PCR获得需要对合成探针的片段进行PCR扩增并胶回收目的片段，回收后浓度一般为20～40ng，可做为探针合成模板使用。
1、生物素标记探针
采用fermentas公司的BiotinDecaLableTM DNALablingKit
1.1.5ml离心管中加入：
DNA（100ng—1ug）xul （一般加入1ug，确保标一次用多次）
5×Reaction Buffer 10ul
Water to 44ul
离心3—5s，100℃孵育5—10min，立即冰浴，然后快速离心。
2.往离心管中加入下列试剂：
Biotin Lableing Mix 5ul
Klenow fragment 1ul
摇晃离心管，离心3—5s。37℃孵育1h，若想增加被标记的DNA的产量，可以延长至20h。
3.加入0.5M EDTA（pH=8.0）1ul终止反应。
4.标记的DNA可直接用于杂交或-20℃保存。对于大部分反应来说出去为标记的DNA是没必要的，如果需要可以通过层析或乙醇沉淀除去不需要的dNTP。
附
1.说明
Biotin DecaLabel™ DNA LabelingKit是一种先进的DNA标记系统，可高效合成生物素标记的探针。标记原理为改进的随机引物方法(由Feinberg和Vogelstein开发(1, 2))。与传统随机引物标记方法相比，该方法的主要改进之处是使用随机十聚体引物代替原来的六聚体引物，确保引物在37°C更有效地与DNA退火。该试剂盒使用的Klenow Fragment, exo-经遗传工程改造，无外切酶活性。该酶在标记时不会降解探针，即使是少量模板也能获得大量标记探针。因此，任何长度的DNA模板都可均一地标记。生物素标记的DNA可经Biotin Chromogenic Detection Kit (#K0661)或者常规的biotinavidin或biotin-streptavidin系统检测出来。
2.原理：
随机十聚体引物与变性DNA分子退火，biotin-dUTP存在时，Klenow Fragment, exo-催化DNA新链的合成。反应过程中，生物素标记的核苷酸掺入到新合成的DNA互补链(见图1)。
图一
二、杂交：
概述：标准杂交液的杂交温度在65℃，加有50%的formamide（去离子甲酰胺）的杂交液的杂交温度为42℃。
1、探针变性：100℃煮沸5min（PCR仪中操作），立即置于冰上5min。
2、将膜封装与杂交袋中，DNA一面朝里，不能有气泡。
3、用5ml注射器注入65℃预热的预杂交液II（美季）5ml（0.1ml/cm2），并用封口机将袋密封，42℃预杂交3h。
注：
1. 1 ml 杂交液对应的膜为1 cm × 18 cm. 在进行杂交时，可以讲杂交膜放置到合适的自封袋（自封袋有一定硬度的类型）中，然后加入杂交液。
2.预杂交是为了减少探针的非特异性结合。因为在杂交膜上，有的位置结合了待测DNA，但有的位置是没有结合任何DNA的。进行杂交时，带标记的探针有可能与膜非特异性结合，造成假阳性。如果在杂交前用与探针没有互补配对序列的鱼精DNA占据了膜上那些空的位置，杂交时，探针就不能与膜非特异性结合了；当然，由于鱼精DNA与探针没有互补配对序列，探针也不能与鱼精DNA结合。
3.甲酰胺干扰碱基堆积力和氢键，能降低Tm值。
4、倒出预杂交液，取一新的杂交袋加入变性的探针（25—100ng/ml）然后加入适量预热的42℃预杂交液（3ml）混匀（此步可以用1ml的杂交液将探针稀释后再加）后封口。放入杂交管中，42℃滚动杂交过夜10—12h。
洗膜：
1、取出杂交袋，倒弃杂交液至废液缸中，夹住露出瓶口的膜的一角将多余的杂交液晾干。
2、将膜没入含有数百毫升的2×SSC，0.1%SDS的皿中，室温轻轻振荡2次每次10min。切忌将膜干燥！
3、将第一次洗液倒入废液缸中，加入数百毫升预热的0.1×SSC，0.1%SDS。,65℃振荡2次每次20min。
注：洗膜的温度应该是解离非特异性杂交体而保留特异性杂交体。其中0.1%SDS可以促进非特异杂交体的解离
注：1.对膜的漂洗是保证阳性结果和背景反差对比好的关键，洗膜不充分会导致背景太深，洗膜过度又可能导致假阴性。
2. 那是为了使杂交结果达到低非特异性背景。如果洗膜与杂交的温度不一样的话，洗脱效果会不是很好，膜上可能有残留的探针，这样会使显影时背景过高。
4.将膜放在滤纸上干燥。
三、显色：
下表中列出试剂盒工作溶液的制备方法及实验步骤：
溶液 | 成分/制备方法 | 储存/稳定性 | 用途 | |
1×Blocking/washing Solution （洗涤缓冲液） | 用无菌水按照1：10的比例将10×1×Blocking/washing Solution稀释成1×工作溶液 | 4℃保存一周 | 封阻膜上非特异结合位点 | |
1×Blocking Solution（阻断液） | 用1×Blocking/washing Solution将Blocking Reagent制成1%的溶液，可以用磁力搅拌器50—60℃搅拌溶解，一旦制成，-20℃保存 | -20℃保存 | ||
Dilution of the streptavidin-Ap Conjugate(抗体溶液) | 每次使用前将原始管中的streptavidin-Ap Conjugate 10000rpm离心5分钟。然后从表面小心吸取所需用量。用封阻溶液按照1：5000（150mU/mL）的比例稀释streptavidin-Ap Conjugate | 即配即用 | 与生物素标记的探针结合 | |
1×Detection Buffer（检测缓冲液） | 用无菌水稀释10×Detection Buffer至一倍 | 4℃保存一周 | ||
Substrate Solution(底物显色液) | 用1×Detection Buffer稀释 50×NBT/BCIP至一倍 注意：避光稀释 | 即配即用，避光 | ||
步骤 | 操作（100cm2） | |||
1 | 杂交和严谨洗涤后，将膜用30mL洗涤缓冲液中等摇晃洗涤5分钟 | |||
2 | 在30mL阻断液中等摇晃孵育30分钟 | |||
3 | 在20mL 抗体溶液中中等摇晃孵育30分钟 | |||
4 | 分别用60mL洗涤缓冲液洗涤两次，每次15分钟 | |||
5 | 在20mL检测缓冲液中平衡10分钟 | |||
6 | 将膜上带有DNA的一面朝上，放入盛有10ml底物显色液的杂交袋，避光，孵育15—30分钟。为了得到更佳的效果，可以将染色过夜。 注：显色时应避光，且戴手套进行。 | |||
7 | 待显色到适合的效果后用去离子水洗膜数秒。 | |||
8 | 弃掉去离子水，干燥，并扫描记录结果。 注意：如果膜用于后续的实验，该膜不应晾干。 | |||
概述：NBT（四唑硝基蓝）为碱性磷酸酶的最佳底物之一，在碱性磷酸酶催化下，BCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐）被水解，BCIP脱磷并聚合而变蓝，过程中放出的H+使NBT还原形成不溶性深蓝色的NBT-Formazan。
本碱性磷酸酯酶标记Streptavidin(AP-labeled Streptavidin)也称AP-Streptavidin、Streptavidin-AP或碱性磷酸酯酶标记链霉亲和素，为进口分装，可以用于生物素(Biotin)标记的抗体、核酸、蛋白或其它生物素标记分子的检测。具体用途包括Western、ELISA、免疫组化或免疫细胞化学、原位杂交、Southern、Northern、EMSA等。
Streptavidin的分子量为66kD，可以高度特异性地和生物素(Biotin)结合。Streptavidin和生物素的亲和常数为Kd=10-15M。Streptavidin是一个4聚体蛋白，可以同时结合4个生物素分子。Streptavidin的中文名为链霉亲和素，从Streptomyces adidinii中纯化获得，和鸡蛋清来源的Avidin(亲和素)在空间结构以及与生物素的亲和力方面具有高度的相似性。和Avidin不同的是，Streptavidin是一种非糖基化蛋白，并且基本不带电荷。Avidin的pI=～10.5，在中性pH条件下呈碱性。由于Streptavidin和Avidin相比在中性条件下不带电荷，因此Streptavidin的非特异性结合比Avidin低很多，这样检测时的非特异性背景就低很多。因此目前在生物素检测时通常使用Streptavidin替代Avidin。
碱性磷酸酯酶即alkaline phosphatase(AP)，可以在Western、EMSA、Southern或Northern等检测时催化BCIP/NBT等显色试剂显色或催化适当的化学发光试剂产生化学发光。
讨论
杂交温度的选择：温度过高，有利于DNA的变性，不利于DNA的复性。温度过低，少数碱基配对形成的局部双链不易解离，难以进行正确的配对。一般大多数杂交以68℃进行，若杂交液中加有甲酰胺，则会降低Tm值，因而杂交温度会降低。一般42℃对大多数杂交是适宜的，GC含量高时可以提高一下杂交温度。另外探针长度较长时，也可提高一下杂交温度。
四．结果及分析
结果
分析
1.Marker显色原理：标记探针的模板是回收的PCR产物，虽然仅仅是回收的目的产物，但由于在电泳时PCR产物跟Marker一同电泳，且Marker为小分子物质容易扩散至PCR产物中，使回收的PCR产物中含有微量的Marker，这样在标记探针时也将Marker也一同标记了，所以在杂交时Marker条带也能出现杂交显影区。
2.由于杂交过程比较长，涉及多个具体步骤，前一个步骤的结果直接影响后续试验，所以必须保证每一步准确无误，时机成熟后才能进行下一步。为了检测每步实验，有必要设置对照分析原因。
（1）没有出现杂交信号或信号弱。
①DNA量不足。
②转移效率低
③固定效果差
④滤膜污染，结合能力差
⑤探针标记效率低，变性不完全，用量不足。
⑥杂交温度不恒定，时间过短。
⑦显影液出问题。
（2）背景混有杂斑
探针标记时未标上的核苷酸直接结合到膜上，造成非特异性杂斑。使用有粉手套也容易出现斑点。
（3）背景深
预杂交时间不够，不能有效封闭非特异性背景；杂交或洗膜过程中部分膜变干；探针直接加于滤膜上，是造成局部黑斑常见的原因，应该加入探针后，轻轻混匀。